Рассчитайте точную массу вставки ДНК, необходимую для определенного молярного соотношения с вашим вектором.
Параметры реакции
Требуемая вставка
50.00ng
Требуемая масса вставки
Ratio3:1I:V
Total DNA100.0ng
Соотношение и масса пластины
Overview
Лигирование соединяет два фрагмента ДНК: вектор (остов) и вставку (интересующий ген). Балансирование количества молекул ДНК (молярное соотношение) имеет решающее значение; слишком большое количество вставок может привести к конкатемерам, а слишком маленькое снижает вероятность столкновения между совместимыми концами.
💡
Pro Tips
Соотношение 3:1 (Вставка:Вектор) является стандартной отправной точкой для большинства перевязок липких концов.
Лигирование тупых концов часто выигрывает от более высоких соотношений (например, 5:1 или 10:1) и более длительного времени инкубации.
Липкие концы (связные концы) имеют нависающие основания, которые обеспечивают специфичность и стабильность реакции.
Убедитесь, что ДНК высокого качества; соли или этанол из наборов для очистки могут ингибировать ДНК-лигазу Т4.
Всегда включайте контрольный параметр «Только вектор» (с лигазой), чтобы проверить фон самолигирования.
!
Fun Facts
"ДНК-лигаза Т4 происходит от бактериофага Т4 и требует АТФ в качестве кофактора."
"ДНК-лигаза была открыта в 1967 году несколькими лабораториями практически одновременно."
"В вашем организме ДНК-лигазы постоянно восстанавливают одноцепочечные разрывы вашего генома."
"Сборка Гибсона и клонирование Golden Gate — это современные альтернативы, в которых используются различные ферменты для достижения бесшовного лигирования."
Formula: Масса вставки = (Масса вектора × [Размер вставки / Размер вектора]) × Отношение
