Określ optymalną temperaturę hybrydyzacji PCR w oparciu o temperaturę topnienia startera i docelowego DNA.
Parametry termiczne
Konfiguracja PCR
66.8°C
Optymalna temperatura wyżarzania
Podkład Tm65.5°C
Ta (Tm-5)60.5°C
Method Comparison
Rychlik (Used)66.8°C
Standard (Tm - 5)60.5°C
*The Rychlik formula is generally more accurate for complex targets.
Overview
Temperatura hybrydyzacji (Ta) jest krytycznym etapem PCR, w którym startery wiążą się z docelowym DNA. Temperatura ta musi być zrównoważona: wystarczająco wysoka, aby startery związały się tylko z idealnym dopasowaniem (specyficznością), ale wystarczająco niska, aby zapewnić skuteczność. W kalkulatorze tym zastosowano wzór Rychlika, który uwzględnia zarówno trwałość podkładu, jak i produktu.
💡
Pro Tips
Optymalna Ta wynosi zazwyczaj 3-5°C poniżej dolnej Tm pary starterów.
Jeśli widzisz niespecyficzne „rozmazy” lub dodatkowe prążki, spróbuj zwiększyć Ta o 1-2°C.
Jeśli nie masz produktu, zmniejsz Ta. Twoje startery mogą nie wiązać się.
Zawartość GC wynosząca 40-60% jest idealna dla starterów, aby uniknąć struktur drugorzędowych lub słabego wiązania.
Touchdown PCR rozpoczyna się od wysokiego Ta i zmniejsza je w każdym cyklu, zapewniając, że najpierw nastąpi najbardziej specyficzne wiązanie.
!
Fun Facts
"Polimeraza Taq, enzym napędzający PCR, pochodzi z Thermus aquaticus, bakterii występującej w gorących źródłach Parku Narodowego Yellowstone."
"Wynalazek PCR przez Kary'ego Mullisa w 1983 roku przyniósł mu Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii."
"Przed zautomatyzowanymi termocyklerami naukowcy musieli ręcznie przenosić rurki pomiędzy trzema łaźniami wodnymi o różnych temperaturach!"
"Nowoczesne enzymy „Fast PCR” mogą wykonać 40 cykli w czasie krótszym niż 15 minut."
